本发明通过鸡全胚成纤维细胞培养鸡传染性喉气管炎病毒及鸡痘病毒，特别是成功使用鸡全胚成纤维细胞培养鸡传染性喉气管炎病毒，获得鸡全胚成纤维细胞培养的鸡传染性喉气管炎病毒及鸡痘病毒，加入适宜的冻干保护剂后，而获得了一种二联冻干活疫苗。该二联冻干活疫苗可以采用翅下皮下刺种的方式免疫接种，既可以减轻鸡传染性喉气管炎活疫苗的副反应，又能简化免疫操作，减少应激反应以及降低生产成本。同时，采用新的配方制备的冻干保护剂，能有效的延长活疫苗的存放时间，为产品的保藏及运输带来了极为便利的条件。
1.一种鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联活疫苗制备方法，其特征在于，使用鸡全胚成纤维细胞分别培养鸡传染性喉气管炎病毒与鸡痘病毒，其中，鸡痘病毒为鹌鹑化鸡痘弱毒株，鸡传染性喉气管炎病毒为鸡胚化弱毒株，将上述两种病毒液按1:1的比例混合，每羽份鸡痘病毒含量为10⁴EID₅₀、鸡传染性喉气管炎病毒含量为
10⁴EID₅₀。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)在形成细胞单层的鸡全胚成纤维细胞中，加入含1％胎牛血清的细胞维持液，pH调至6.8，接种鸡痘病毒，吸附并培养至CPE大于80％以上时停止培养，收获鸡痘病毒；2)在形成细胞单层的鸡全胚成纤维细胞中，加入含1％胎牛血清的细胞维持液，pH调至6.8，接种鸡传染性喉气管炎病毒，吸附并培养至CPE大于80％以上时停止培养，收获鸡传染性喉气管炎病毒；3)将上述两种病毒液按1:1的比例混合，混合后定量分装，即制成二联活疫苗。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)还包括在混合后的病毒液中，加入冻干保护剂，经冷冻真空干燥，以获得鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联冻干活疫苗的步骤。
4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法制备的鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联活疫苗。
5.根据权利要求3所述的制备方法制备的二联冻干活疫苗，其特征在于，所述的冻干保护剂包括以下组分：A液：L-谷氨酸钠3％W/V，蔗糖7％W/V，D-山梨醇2％W/V，硫代硫酸钠2％W/V，维生素C0.2％W/V，余量为水；B液：聚乙烯吡咯烷酮3％W/V，余量为水；A液和B液体积配比为1:1。
6.权利要求4-5任意一项所述的二联活疫苗在制备预防或治疗鸡传染性喉气管炎和鸡痘病的药物中的应用。
7.权利要求4-5任意一项所述的二联冻干活疫苗在制备预防或治疗鸡传染性喉气管炎和鸡痘病的药物中的应用。
8.根据权利要求6或7所述应用，其特征在于，所述疫苗是通过翅下皮下刺种免疫接种的。技术领域
本发明涉及一种鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联活疫苗，特别是指一种鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联冻干活疫苗，属于兽用疫苗领域。
背景技术
鸡传染性喉气管炎是由传染性喉气管炎病毒引起的一种急性、接触性上部呼吸道传染病。其特征是呼吸困难、咳嗽和咳出含有血样的渗出物。剖检时可见喉部、气管粘膜肿胀、出血和糜烂。在病的早期患部细胞可形成核内包涵体。本病1925年在美国首次报道后，现已遍及世界许多养鸡地区。本病传播快，死亡率较高，在我国较多地区发生和流行，危害养鸡业的发展。鸡痘是由鸡痘病毒引起的传染病，多年来在全国各地都有发生。尤其在秋季，根据症状和病变的表现，鸡痘可分为皮肤型、白喉型和混合型。一般以皮肤型者居多，它在冠、肉垂、嘴角、眼皮、耳球和腿、脚、泄殖腔以及翅的内侧等部位形成一种特殊的痘疹。病鸡往往精神萎顿，鸡群采食量减少，明显消瘦，生长受阻，发育不良等。白喉型鸡痘主要在喉头及气管中产生多量黄色干酪样或脓样物，堵塞咽喉，造成病鸡呼吸困难，因气流不畅，喉部发出“咯......咯”的尖叫声，患鸡因停食衰竭和窒息而死亡。混合型鸡痘具备上述两型鸡痘特征，死亡率更高，严重者可高达30％-40％，给养鸡业带来巨大的经济损失。通常情况下，鸡群发生温和性及皮肤型痘时，死亡率较低，而发生全身性感染，特别是发生白喉型，或者有并发感染传染性喉气管炎及环境条件差时，死亡率较高，给鸡场带来严重的损失。疫苗免疫是控制这两种病的根本措施，目前使用最多的是鸡痘病毒鹌鹑化株弱毒活疫苗，通过刺种的方法免疫；及鸡传染性喉气管炎弱毒鸡胚组织苗，采用滴鼻点眼方式接种来防治。因为接种方式不同，这两种病需要至少需要两次接种才能预防，多次接种不仅养殖成本上升，而且多次对鸡体产生刺激，影响免疫效果。另外，由于鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗点眼后往往引起免疫鸡结膜发炎、失明等严重副反应，给养鸡户带来一定损失。
发明内容
本发明通过鸡全胚成纤维细胞培养鸡传染性喉气管炎病毒及鸡痘病毒，特别是成功使用鸡全胚成纤维细胞培养鸡传染性喉气管炎病毒，获得鸡全胚成纤维细胞培养的鸡传染性喉气管炎病毒及鸡痘病毒，进而通过对两种病毒液比例进行调整，使得两种病毒抗原相互无影响，加入适宜的冻干保护剂后，而获得了一种二联冻干活疫苗。该二联冻干活疫苗可以采用翅下皮下刺种的方式免疫接种，既可以减轻鸡传染性喉气管炎活疫苗的副反应，又能简化免疫操作，减少应激反应以及降低生产成本。同时，采用新的配方制备的冻干保护剂，能有效的延长活疫苗的存放时间，为产品的保藏及运输带来了极为便利的条件。技术方案即本发明的主要目的在于提供一种鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联活疫苗，其含有鸡传染性喉气管炎病毒，与鸡痘病毒。优选地，本发明所述的鸡传染性喉气管炎病毒，与所述的鸡痘病毒均使用鸡全胚成纤维细胞培养获得的。优选地，本发明所述的鸡传染性喉气管炎病毒含量为10⁶/0.1mlEID₅₀，鸡痘病毒含量为10⁶/0.1mlxa0EID₅₀。优选地，本发明所述的二联活疫苗为使用鸡痘病毒与鸡传染性喉气管炎病毒两种病毒液按1∶1的体积比例混合，使二联活疫苗中每羽份鸡痘病毒含量为10⁴EID₅₀、鸡传染性喉气管炎病毒含量为10⁴EID₅₀。本发明还提供了一种鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联冻干活疫苗，即使用上述二联活疫苗，加入冻干保护剂，经冷冻干燥后获得。优选地，本发明所述的冻干保护剂包括以下组分：A液：L-谷氨酸钠3％W/V，蔗糖7％W/V，D-山梨醇2％W/V，硫代硫酸钠2％W/V，维生素Cxa00.2％W/V，余量为水；B液：聚乙烯吡咯烷酮3％W/V，余量为水；A液和B液体积配比为1∶1。本发明还提供了一种鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联活疫苗制备方法，其中，使用鸡全胚成纤维细胞分别培养鸡传染性喉气管炎病毒与鸡痘病毒。优选地，本发明二联活疫苗的制备方法包括以下步骤：1)在形成细胞单层的鸡全胚成纤维细胞中，加入含1％胎牛血清的细胞维持液，pH调至6.8，接种鸡痘病毒，吸附并培养至CPE大于80％以上时停止培养，收获鸡痘病毒；2)在形成细胞单层的鸡全胚成纤维细胞中，加入含1％胎牛血清的细胞维持液，pH调至6.8，接种鸡传染性喉气管炎病毒，吸附并培养至CPE大于80％以上时停止培养，收获鸡传染性喉气管炎病毒；3)将上述两种病毒液按1∶1的比例混合，混合后定量分装，即制成二联活疫苗。优选地，本发明上述步骤3)还包括在混合后的病毒液中，加入冻干保护剂，经冷冻真空干燥，以获得鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联冻干活疫苗的步骤。因此，本发明提供了上述二联活疫苗在预防或治疗鸡传染性喉气管炎和鸡痘病中的应用；以及二联冻干活疫苗在预防或治疗鸡传染性喉气管炎和鸡痘病中的应用。技术效果由上可以看出，首先，本发明通过鸡胚成纤维细胞培养获得了鸡传染性喉气管炎病毒与鸡痘病毒，特别是成功地使用鸡全胚成纤维细胞培养获得了滴度足够够高的鸡传染性喉气管炎病毒与鸡痘病毒，因此，可以实现方便、快捷地实现了鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联活疫苗及冻干活疫苗的大规模生产；其次，发明人创造性选择使用翅下皮下刺种的方法，优于以前的滴鼻点眼方式接种鸡传染性喉气管炎疫苗，节约了接种步骤和时间，并获得了同时预防或治疗鸡传染性喉气管炎和鸡痘病的效果；此外，本发明的二联疫苗和冻干活疫苗安全性较佳，抗原间无相互干扰，免疫效果大于单苗的免疫效果；最后，通过加入合适冻干保护剂，延长冻干疫苗的保藏时间，为产品的运输与储存提供了方便。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例11.鸡全胚成纤维单层细胞制备方法选取10日龄SPF鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，用0.1％新洁尔灭和2％碘酊对蛋壳表面做消毒处理，无菌挑出鸡胚放入灭菌容器中，加入维持液洗涤3遍，彻底洗掉血液和粘性代谢物质。用灭菌剪刀将胚体剪成米粒大小的组织碎块，分别倒入盛有灭菌玻璃珠的500ml中性玻璃瓶中，视组织块的多少加入0.25％胰蛋白酶消化液(1∶4)。然后放入37℃水浴锅中消化25分钟(期间要轻摇3次使胰酶与组织碎块充分接触)，待组织块呈蓬松绒毛状时停止消化。倒出胰酶消化液，再用维持液轻洗消化好的组织块3遍，以彻底洗脱胰酶消化液。随后加入维持液由轻渐重摇晃分散细胞，静置5分钟，上清经6层灭菌纱布过滤。将得到的细胞悬液加入所需含5％胎牛血清的生长液，pH调至7.2.分装于小方瓶中，于37℃培养。2.病毒液的制备鸡痘病毒液的制备：待上述细胞培养24h已经基本形成致密的细胞单层，倒出培养液，加入含1％胎牛血清的维持液，pH调至6.8，同时按培养液总量的3％接种鸡痘生产种毒(鹌鹑化鸡痘弱毒株，购自中国兽医药品监察所，保藏号CVCCxa0AV1003)，并吸附一个小时，然后补加细胞维持液，并于同条件下继续培养。接毒后每天肉眼或低倍显微镜下观察细胞病变，待80％以上单层细胞出现细胞圆缩、空斑或拉网脱落等病变时停止培养，-15℃冷冻保藏。鸡传染性喉气管炎病毒液的制备：待上述细胞培养24h已经基本形成致密的细胞单层，倒出培养液，加入含1％胎牛血清的维持液，pH调至6.8，同时按培养液总量的3％接种鸡传染性喉气管炎生产种毒(鸡胚化弱毒株，购自中国兽医药品监察所，保藏号CVCCxa0AV23)，并吸附一个小时，然后补加细胞维持液，并于同条件下继续培养。接毒后每天肉眼或低倍显微镜下观察细胞病变，待80％以上单层细胞出现细胞圆缩、空斑或拉网脱落等病变时停止培养，-15℃冷冻保藏。3.病毒含量测定鸡痘病毒液病毒含量：将上述制备的鸡痘病毒液进行10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7四个稀释度，每个稀释度绒毛尿囊膜接种9-11日龄SPF鸡胚6枚，每胚0.1ml，置37℃孵育，接种后24小时内死亡的鸡胚弃去不计，每个稀释度的活胚数不应少于4枚。7日后观察鸡胚的感染情况。根据Reed-Muench法计算EID₅₀，对鸡胚最小感染量为10⁶EID₅₀/0.1ml。鸡传染性喉气管炎病毒液病毒含量：将上述制备的鸡传染性喉气管炎病毒液进行10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7四个稀释度，每个稀释度绒毛尿囊膜接种9-11日龄SPF鸡胚6枚，每胚0.1ml，置37℃孵育，接种后24小时内死亡的鸡胚弃去不计，每个稀释度的活胚数不应少于4枚。7日后观察鸡胚的感染情况。根据Reed-Muench法计算EID₅₀，对鸡胚最小感染量为10⁶EID₅₀/0.1ml。4.冻干保护剂的制备A液组成成分为：L-谷氨酸钠3g，蔗糖7g，D-山梨醇2g，硫代硫酸钠2g，维生素Cxa00.2g，完全溶解后用注射用水补至100mL。经0.22μm滤膜过滤除菌，备用。B液组成成分为：聚乙烯吡咯烷酮3g，完全溶解后用注射用水补至100mL。116℃高压灭菌30分钟，备用。A液和B液按照1∶1的体积配比混合，即为冻干保护剂。5.鸡痘、传染性喉气管炎二联活疫苗的配制将上述检验合格的鸡痘、传染性喉气管炎两种病毒液按1∶1的比例混合，混合后定量分装，每羽份病毒含量鸡痘病毒为10⁴EID₅₀，每羽份鸡传染性喉气管炎病毒为10⁴EID₅₀。分装后加入冻干保护剂，经冷冻真空干燥制成冻干活疫苗。制备三批，分别是S101、S102和S103。6.疫苗的安全性检验取35日龄的SPF鸡40只，随机分成4组，每组10只，第1-3组为试验组，分别翅膀内侧无血管处皮下刺种3批二联苗，每只0.1ml(含10羽份)；第4组为对照组，不作任何处理。免疫组鸡接种后连续21天每天进行观察，观察免疫组鸡和对照组鸡的精神状态和全身反应。检查是否有眼炎、头部肿胀和呼吸道症状等鸡传染性喉气管炎症状，同时检查刺种部位是否有肿胀等局部反应及肿胀消失时间。结果3批疫苗0.1ml(含10羽份)对35日龄的鸡进行翅下皮下刺种后，连续观察21天内，全部免疫组鸡接种后3-5日出现鸡痘疫苗接种后的正常局部反应，接种部位出现痘肿，并在接种后9-12日消失，没有出现融合性的结痂，不发生全身痘。免疫组鸡和对照组鸡精神、食欲和发育均正常，没有出现眼炎和呼吸道症状，无全身不良反应。表1二联苗安全性试验结果ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>7.疫苗的免疫效力试验取35日龄的SPF鸡80只，随机分成8组，每组10只。第1-3组和5-7组为疫苗接种组，第1-3组分别翅下皮下刺种3批二联苗，每只鸡0.1ml(含1/100羽份)；第5-7组分别翅下皮下刺种3批二联苗，每只鸡0.1ml(含1羽份)；第4组和第8组分别作为鸡痘阳性对照组和鸡传染性喉气管炎阳性对照组，不接种疫苗。接种后14日，取1-4组的试验鸡，用10^-4稀释的鸡痘病毒102株病毒液(购自中国兽医药品监察所，保藏号CVCCxa0AV1001)进行毛囊涂抹攻毒，每只鸡0.1ml，攻毒后观察14日，每天进行两次，观察鸡的发病情况。鸡痘发病鸡判断标准为：在羽毛囊擦拭部位出现典型的鸡痘病毒引起的损伤，即痘斑。接种后21日，取5-8组的鸡，用鸡传染性喉气管炎病毒北京株病毒液(购自中国兽医药品监察所，保藏号CVCCxa0AV22)气管内注射进行攻毒，每只鸡0.1ml(含10⁴EID₅₀)，攻毒后观察14日，每天进行两次，观察鸡的发病情况。鸡传染性喉气管炎发病鸡的判定标准为：1)喘气或呼吸困难；2)啰音；3)打喷嚏；4)结膜炎；出现上述症状之一即判为发病。3批二联苗免疫1/100羽份的剂量免疫35日龄的鸡后14日，对鸡痘强毒102株攻毒产生可靠的攻毒保护，攻毒保护率均达到10/10(对照组鸡10/10发病)。鸡痘强毒102株攻毒后，免疫组鸡全部没有局部不良反应和全身症状，接种部位出现痘肿，并在接种后9-12日消失，没有出现融合性的结痂，不发全身痘。对照组鸡攻毒部位全部出现痘斑，严重者出现融合性结痂，有的发生破溃流水和浓汁。3个鸡传染性喉气管炎病毒北京株强毒攻毒组的保护率均达到10/10(对照组鸡10/10发病)，没有出现局部和全身症状。对照组鸡均出现呼吸困难、流泪、伸颈呼吸、打喷嚏的鸡传染性喉气管炎症状。可见二联苗能有效的预防鸡痘及鸡传染性喉气管炎，可对鸡群产生有效的攻毒保护。表2二联苗免疫效力试验结果ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>8.疫苗的保存期试验将3批二联冻干活疫苗S101、S102、S103存放于2℃-8℃条件下保存，按照保存6个月、12个月、18个月、24个月及30个月进行效价测定。将疫苗用生理盐水稀释至1羽份/0.5ml，分贝装入两支试管中，每管1ml。第1管加入等量的鸡痘抗血清，第2管加入等量的鸡传染性喉气管炎抗血清。在室温中和1小时(中间摇1次)。然后分别进行10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6五个稀释度每个稀释度绒毛尿囊膜接种9-11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃孵育，接种后24小时内死亡的鸡胚弃去不计，每个稀释度的活胚数不应少于4枚。7日后观察鸡胚的感染情况。根据Reed-Muench法计算EID₅₀。根据检测结果，3批冻干活疫苗在2℃-8℃条件下保存30个月后，效价基本无减损，符合要求。表3二联疫苗保存期试验ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>9.结论试验结果表明，二联苗对试验鸡翅下内侧皮下接种能产生良好的免疫力。试验鸡免疫1/100的使用剂量，全部出现局部痘肿，攻毒试验全部试验鸡可抵抗鸡痘强毒的攻击。试验鸡翅下内侧皮下接种1个使用剂量的二联疫苗，攻击鸡传染性喉气管炎强毒，能全部获得保护。说明改变了鸡传染性喉气管炎疫苗的接种途径后，不仅克服了点眼途径引起的副反应，对鸡传染性喉气管炎强毒的攻击还能得到有效的免疫保护，达到了预期的免疫效果，同时能够一针防两病，省时省力。通过对保存期试验验证，二联疫苗采用新的配方组成的冻干保护剂，能有效的延长疫苗在2℃-8℃条件下的保存时间，产品在2℃-8℃条件下，能保存30个月以上，降低保藏成本，有利于产品的运输及推广。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。